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Oct 14, 2023

3D 콜라겐 지지체의 세포 수를 추정하기 위한 새로운 입체 방법

과학 보고서 13권,

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 7959(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

3D 지지체에서 세포 증식을 평가하는 현재 방법은 대사 활동 또는 총 DNA의 변화에 ​​의존하지만, 3D 지지체에서 세포 수를 직접 정량화하는 것은 여전히 ​​어려운 과제로 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 체계적인 무작위 샘플링과 스캐폴드의 얇은 초점면 광학 단면을 사용하고 총 세포 수(StereoCount)를 추정하는 편견 없는 입체 접근 방식을 개발했습니다. 이 접근법은 총 DNA(DNA 함량)를 측정하는 간접적인 방법에 대해 검증되었습니다. 및 세포 수를 정량화하기 위한 현재 기준 방법인 Bürker 계수 챔버. 우리는 네 가지 값에 걸쳐 세포 파종 밀도(단위 부피당 세포)에 대한 총 세포 수를 평가하고 정확성, 사용 용이성 및 시간 요구 측면에서 방법을 비교했습니다. StereoCount의 정확도는 ~ 10,000 및 ~ 125,000 세포/스캐폴드의 경우 DNA 함량보다 훨씬 뛰어났습니다. ~ 250,000 및 ~ 375,000 세포/스캐폴드의 경우 StereoCount와 DNA 함량 모두 Bürker보다 정확도가 낮았지만 서로 다르지 않았습니다. 사용 용이성 측면에서 StereoCount는 절대 세포 수 측면의 출력과 세포 분포 개요 및 향후 높은 처리량 분석을 위한 자동화 사용 가능성으로 인해 강력한 이점이 있었습니다. 종합하면, StereoCount 방법은 3D 콜라겐 지지체에서 직접 세포 정량화를 위한 효율적인 접근 방식입니다. 주요 이점은 자동화된 StereoCount가 다양한 인간 질병에 대한 약물 발견에 초점을 맞춘 3D 비계를 사용하여 연구를 가속화할 수 있다는 것입니다.

정의된 부피의 세포 수를 정량화하는 것은 전 세계 생명과학자 및 전임상 연구자 커뮤니티에 필수적인 측정 기준입니다. 3D 콜라겐 스캐폴드와 같이 세포를 3D 볼륨으로 분산시키는 분야에서는 실험 시작, 즉 세포 파종 및 시간 경과에 따른 세포 사멸 및 증식 평가를 위해 신뢰할 수 있는 세포 추정치가 필요합니다. 이러한 경우 세포 수를 열거하는 것은 두 가지 주요 접근법으로 제한됩니다. 균질한 세포 현탁액(액상)에서 직접 세포 수를 계산하는 Bürker 챔버; 전체 DNA 추정을 위한 형광 기반 접근법(예: CyQuant®1,2). 전체 DNA 접근법의 단점은 콜라게나제에 의한 스캐폴드 소화와 같은 샘플 전처리로 인한 세포 용해와 정확한 판독 및 세포 수에 대한 신호 강도의 선형성 간의 상관 관계를 보장하기 위해 각 실험에 대한 교정 곡선이 필요하다는 것입니다. 따라서 3D 지지체의 세포 수를 추정하기 위한 직접적인 정량적 방법은 없습니다.

이 문제를 해결하기 위해 우리는 3D 콜라겐 지지체의 절대 세포 수를 직접 정량화하기 위한 새로운 입체 기반 방법인 StereoCount™를 소개합니다(그림 1).

3D 콜라겐 스캐폴드에는 세포가 파종되어 세포 수의 정량화에 사용됩니다.

재료 및 방법과 그림 2에 자세히 설명된 대로 형광 현미경 검사와 광학 절편 및 이미지 분석을 사용하는 접근 방식을 보여줍니다. 둘째, 수동 계산으로 인한 편향을 방지하고 처리량을 향상시키기 위해 FIJI-ImageJ3을 사용하여 자동화된 작업 흐름을 소개합니다. 두 개의 매크로 스크립트와 중간 수준의 얕은 기계 학습(NL) 기반 단계를 사용합니다. 장점 중 하나는 이 방법이 스캐폴드 소화 또는 마이크로톰 절편을 필요로 하지 않으며 현미경 기반 접근 방식으로서 스캐폴드의 세포 분포에 대한 개요를 추가 정보로 제공한다는 것입니다. 여기에서는 전체 DNA의 형광 검출을 기반으로 한 DNA 함량 방법과 StereoCount를 비교하고 대조합니다. 세포 정량화를 위해 일반적으로 신뢰할 수 있는 방법인 계수 챔버 방법(Bürker)을 사용하여 세포 수를 계산합니다.

현미경 검사 중 StereoCount 샘플링 절차. 3차원(3D) 콜라겐 스캐폴드는 9개의 XY 시야와 30개의 Z 스택으로 샘플링됩니다. 얇은 초점면 광학 스캐닝(광학 분리기 방법)을 사용하여 각 열에 대한 세포 수를 결정합니다. 컬럼의 세포 수는 콜라겐 지지체의 전체 부피로 다시 계산됩니다.