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메탄올 고정은 액적에 대한 선택 방법입니다.

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메탄올 고정은 액적에 대한 선택 방법입니다.

커뮤니케이션 생물학 볼륨

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 522(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

단일 세포 전사체학의 주요 중요한 단계는 시료 준비입니다. 라이브러리 준비에서 샘플 처리를 분리하기 위해 해리 후 세포를 보존하기 위한 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법의 적합성은 처리할 세포 유형에 따라 달라집니다. 이 프로젝트에서는 유도만능줄기세포에서 유래한 신경교세포와 신경교세포에 대한 액적 기반 단일 세포 RNA-seq의 보존 방법을 체계적으로 비교합니다. 우리의 결과는 DMSO가 세포당 검출된 RNA 분자 및 유전자 측면에서 최고의 세포 품질을 제공하지만 세포 구성에 큰 영향을 미치고 스트레스 및 세포사멸 유전자의 발현을 유도한다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, 메탄올 고정 샘플은 신선한 샘플과 유사한 세포 구성을 표시하고 우수한 세포 품질을 제공하며 발현 편향이 거의 없습니다. 종합하면, 우리의 결과는 메탄올 고정이 신경 세포 집단에 대한 액적 기반 단일 세포 전사체학 실험을 수행하기 위한 선택 방법임을 보여줍니다.

단일 세포 전사체학(scRNA-seq) 방법은 개인, 조직, 심지어 질병 전반에 걸쳐 유전자 발현을 높은 처리량 방식으로 연구하는 방식에 혁명을 일으켰습니다1,2,3. 이전에는 대량의 유전자 발현 수준, 즉 특정 샘플을 구성하는 세포 집단의 변화를 확인하는 연구가 제한되었습니다. 따라서 이러한 접근법은 두 가지 다른 효과, 즉 관심 샘플의 세포 구성 변화와 개별 세포 내 유전자 발현 변화를 혼합했습니다. 이제 scRNA-seq을 사용하면 이 두 가지 효과를 독립적으로 평가할 수 있으며 세포 구성의 변화4,5와 특정 세포 유형6,7의 유전자 발현 변화를 모두 감지할 수 있습니다.

scRNA-seq 방법의 인기에도 불구하고 아직 해결되지 않은 몇 가지 기술적 과제가 있습니다. 예를 들어, 조직에서 세포를 분리하고 scRNA-seq에 필요한 좋은 세포 현탁액을 얻는 것은 매우 조직 특이적이며 효소 소화, 기계적 분해, 형광 활성화 세포를 포함한 다양한 전략의 사용이 필요할 수 있습니다. 정렬 및 기타 기술8,9,10,11,12. 결과적으로, scRNA-seq용 샘플을 준비하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 나중에 샘플을 처리하는 것이 더 편리합니다. 기술적인 어려움 외에도, 외부 시설로 샘플을 배송하는 등 다른 이유로 샘플 해리와 처리를 분리해야 하거나 여러 샘플을 수집하여 나중에 함께 처리하려는 경우 세포 보존도 중요합니다. 시간이나 돈을 절약하기 위해. 이 모든 경우에 연구자들은 원래 샘플과 비교하여 개별 세포의 세포 구성 및 유전자 발현의 차이를 최소화하는 방식으로 이러한 샘플을 보존하고자 합니다. 즉, 최상의 보존 방법은 시료의 세포 구성과 개별 세포의 전사체 프로필에 가장 작은 영향을 미치는 방법이 될 것입니다.

이 문제를 극복하고 라이브러리 준비에서 샘플 처리를 분리하기 위해 여러 가지 세포 보존 방법이 이미 개발되었습니다. 그 중에서 우리는 메탄올 고정13,14, 디티오-비스 숙신이미딜 프로피오네이트15, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 냉동 보존16,17, 아세트산 메탄올(ACME)10, 파라포름알데히드18, CellCover17 및 vivoPHIX19를 포함한 수제 및 상업용 솔루션을 모두 찾습니다. 이러한 방법은 세포의 샘플 구성과 RNA 품질을 유지하는 것을 목표로 합니다. 그러나 샘플 준비가 조직별로 다르다는 점을 고려하면 다양한 샘플에 대해 다양한 보존 방법이 최적일 수 있을 것으로 기대합니다. 이러한 프로토콜 중 다수는 세포주 또는 말초 혈액 세포와 같이 쉽게 얻을 수 있는 세포에서만 테스트되었으므로 해리가 어렵거나 해리 중에 잠재적으로 손상되는 세포에서 성능이 어떻게 되는지는 명확하지 않습니다. 특히, 이전 방법 중 어느 것도 성숙한 뉴런이나 신경 질환을 유발하는 분자 메커니즘을 연구하기 위한 신경 세포의 주요 공급원인 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 유래 뉴런에서 테스트되지 않았습니다.

 = 0.8), although ACME and vivoPHIX samples have slightly lower correlations with all other samples (Supplementary Fig. 7). This lower correlation can be explained by global or cell-type-specific changes in gene expression but also by compositional biases. To investigate this further, we generated pseudobulk counts for each of the clusters for each sample separately and performed a correlation analysis at the cluster level. Our analyses show that the fixation method induces biases in the clustering of cell populations across samples (Supplementary Fig. 8). However, the high similarity between different clusters, i.e., NPC populations, makes cell clusters preserved with a particular method cluster together. To address this issue, we evaluated the clustering of samples for each cell cluster independently using sigclust229, a statistical method designed to test the statistical significance of hierarchical clustering. As can be seen in Fig. 5, in all cases methanol samples clustered with fresh samples. In contrast, in 8 of the 12 cell populations identified, several vivoPHIX and ACME samples cluster separately from fresh samples. This analysis thus confirms that the overall expression profile of methanol-fixed cells in each cluster is more similar to that of fresh cells than that of cells preserved using other methods./p> = |0.58| and an adjusted Wald test P value <0.05. vivoPHIX and methanol samples have more DEGs across clusters, while the number of DEG in DMSO is close to zero./p>0.58 are available in Supplementary Data 6 and in Fig. 6c. To assess if the different fixation/preservation methods introduced biases in the expression of particular gene sets, we investigated the biological processes associated to up and downregulated genes using the enrichr function of the GSEApy package47. For this analysis, we used all genes that were consistently up- or downregulated across at least four cell types for each fixation/preservation method. Only gene sets with at least ten genes were analyzed. As background set for the enrichment analysis, we provided all genes expressed in the dataset which had at least 445 UMIs, which is the minimum expression among the DEGs identified. Across all comparisons, we did not identify any significantly overrepresented gene ontology term (hypergeometric test adjusted P value <0.001)./p>