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Mar 18, 2023

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Nature Communications 14권, 기사 번호: 2734(2023) 이 기사 인용

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포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직은 임상 이력 및 후속 데이터를 위한 방대하고 귀중한 환자 자료 은행을 구성합니다. FFPE 조직에서 단일 세포/핵 RNA(sc/snRNA) 프로파일을 달성하는 것은 여전히 ​​어려운 일입니다. 여기에서는 무작위 프라이머로 전체 길이의 전체 RNA를 캡처하여 FFPE 조직을 위한 액적 기반 snRNA 시퀀싱 기술(snRandom-seq)을 개발합니다. snRandom-seq는 최첨단 고처리량 scRNA-seq 기술과 비교하여 약간의 이중 비율(0.3%), 훨씬 더 높은 RNA 적용 범위를 보여주며 더 많은 비코딩 RNA 및 초기 RNA를 감지합니다. snRandom-seq는 핵당 >3000개 유전자의 중앙값을 감지하고 25개의 일반적인 세포 유형을 식별합니다. 또한 우리는 임상 FFPE 인간 간암 표본에 snRandom-seq를 적용하고 높은 증식 활성을 갖는 흥미로운 핵 하위 집단을 밝힙니다. 우리의 방법은 임상 FFPE 표본을 위한 강력한 snRNA-seq 플랫폼을 제공하고 생물의학 연구에 엄청난 응용을 약속합니다.

일상적인 FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매) 조직은 가장 일반적으로 보관 가능한 표본으로, 임상 이력, 추적 데이터 등을 위한 방대하고 귀중한 환자 자료 은행을 구성합니다1. FFPE 조직의 조직 형태와 세포 세부 사항은 DNA, RNA 및 단백질 간의 포름알데히드 가교에 의해 조직병리학을 위해 잘 보존됩니다. 필연적으로, FFPE 샘플의 거대분자에 대한 포르말린 고정으로 인한 돌이킬 수 없는 변형은 항상 분자 생물학 응용을 어렵게 만듭니다. 최근 연구에서는 최적의 RNA 추출 방법2 또는 공간 현장 프로파일링3을 통해 FFPE 샘플의 전사 프로파일링에 큰 진전이 있었습니다. 지난 몇 년 동안 처리량이 높은 단일 세포/핵 RNA 시퀀싱(scRNA/snRNA-seq) 방법은 전체 생물의학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다4,5,6. 우리는 맞춤형 고처리량 scRNA-seq 플랫폼7,8을 사용하여 최초의 인간 및 마우스 세포 아틀라스를 구축했습니다. 임상 FFPE 표본의 모든 단일 세포에 대한 정확한 전사체 특성 분석은 세포 이질성과 집단 역학에 대한 더 나은 이해를 제공하여 인간 질병의 정밀한 진단, 치료 및 예후를 향상시킬 수 있는 능력이 있다고 믿어집니다. 그러나 단일 온전한 세포/핵 분리와 FFPE 조직으로부터의 RNA 포획은 RNA 가교, 변형 및 분해로 인해 여전히 어려운 과제입니다.

현재 10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution과 같은 가장 인기 있는 고처리량 sc/snRNA-seq 플랫폼은 주로 성숙한 메신저 RNA(mRNA)가 폴리(A)+ RNA를 캡처하기 위해 올리고(dT)를 사용합니다. 분석을 위해 폴리아데닐화되지 않은 RNA가 아닌 검출될 수 있습니다. 또한, 올리고(dT) 프라이머는 일반적으로 분해된 RNA에서 실패하기 때문에 이러한 올리고(dT) 기반 sc/snRNA-seq 방법은 주로 신선하거나 신선하게 냉동된 샘플로 제한됩니다. 다양한 관점에서 이러한 과제를 극복하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. SMART-seq-total9 및 VASA-seq10은 모든 RNA 분자를 폴리(A)로 테일링하는 추가 단계를 전개하여 폴리아데닐화 및 비폴리아데닐화 전사체를 모두 캡처합니다. 반면에, SPLiT-seq11은 전체 RNA를 포획하는 데 더 효율적이고 더 광범위한 무작위 프라이머를 사용하여 고정된 세포에서 성공적으로 사용되는 것으로 보고되었습니다. 그러나 이러한 방법은 아직 FFPE 조직에서는 실행 가능하지 않았습니다. 최근 bioRxiv에 게시된 두 가지 방법인 snPATHO-Seq14 및 snFFPE-seq15는 FFPE 조직에서 온전한 단일 핵을 분리하여 snRNA-Seq를 수행하는 최적화된 방법을 제공했습니다. 이는 FFPE 조직에서 snRNA-Seq의 타당성을 입증하고 차원을 잠금 해제합니다. 사용하기 어려운 샘플 중 하나입니다. snPATHO-Seq는 제한된 유전자만 검출할 수 있도록 프로브 기반 10X Genomics 기술을 사용합니다14. snFFPE-seq는 폴리(A) 기반 10X Genomics 플랫폼을 활용하는데, 이는 FFPE 조직에서 낮은 품질의 RNA를 캡처할 만큼 민감하지 않습니다. 실제로 예측 바이오마커 또는 희귀 세포 유형을 식별하려면 임상 검체에 대한 대규모의 포괄적인 전사체 프로파일링이 항상 필요합니다. 따라서 가장 중요한 목표는 FFPE 조직에서 높은 처리량, 고감도 및 높은 적용 범위 snRNA-seq에 대한 요구를 충족할 수 있는 접근 방식을 갖는 것입니다.