Oct 19, 2023
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커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 173(2023) 이 기사 인용
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생체 공학적으로 성숙된 인간 뇌 오가노이드는 생체 내 뇌 발달, 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환을 요약하는 매우 가치 있는 3차원 체외 뇌 모방 모델입니다. 형태 형성, 발달 단계, 세포 운명 전환, 세포 이동, 줄기 세포 기능 및 면역 반응을 포함한 여러 생물학적 과정에 영향을 미치는 다양한 지시 신호가 생리적으로 기능적인 대뇌 오가노이드의 생성에 사용되었습니다. 그러나 성숙을 위한 현재의 접근 방식은 배치 간 변동성이 감소된 수확 가능성이 높고 기능적인 대뇌 오가노이드에 대한 개선이 필요합니다. 여기서 우리는 고품질 대뇌 오가노이드의 수확 가능성, 재현성 및 생존을 향상시키고 기존의 오가노이드와 비교하기 위해 회전 세포 배양 시스템(RCCS) 미세 중력 생물 반응기와 새로 설계된 미세 유체 플랫폼(μ-플랫폼)이라는 두 가지 엔지니어링 접근 방식을 보여줍니다. 스피너 및 셰이커 시스템. RCCS 및 µ-플랫폼 오가노이드는 이상적인 크기, 약 95% 수확 가능성, Ki-67 + /CD31 + /β-카테닌+ 증식성, 접착성 및 내피 유사 세포를 사용한 배양 시간 연장 및 풍부한 세포 다양성(풍부한 신경/교세포/ 내피 세포 집단), 구조적 뇌 형태 형성, 전체 인간 두뇌 발달 동안의 추가 기능적 신경 정체성(글루타메이트 분비 글루타메이트성, GABA성 및 해마 뉴런) 및 시냅스 생성(시냅스 전-시냅스 후 상호 작용). 두 오르가노이드는 모두 60일째 높은 수준에서 CD11b + /IBA1 + 미세아교세포 및 MBP + /OLIG2 + 희소돌기아교세포를 발현했습니다. 높은 수준의 생리학적 충실도를 보여주는 RCCS 및 µ-플랫폼 오르가노이드는 테스트를 위한 기능적 전임상 모델 역할을 할 수 있습니다. 신경 질환에 대한 새로운 치료법과 다중 요법의 이점.
뇌 생성, 성숙 및 기능 발달에 대한 이해는 진화적인 뇌 발달을 이해하고 신경퇴행성 및 신경발달 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다1,2. 동물 모델은 기계적 검사에 유용하지만 인간 두뇌 발달의 요약은 세포 및 분자 수준의 차이로 인해 크게 제한됩니다3. 더욱이, 인간 두뇌에 대한 우리의 현재 지식의 대부분은 실험 조작에 부적합한 사후 또는 병리학적 표본의 분석을 기반으로 합니다4. 최근에는 리프로그래밍 인자(OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4)에 의해 지속적으로 재생되고 체내 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 유도만능줄기세포(iPSC)가 인간 신경 연구에 새로운 지평을 열었습니다. 개발5. Lancaster et al.6이 발표한 최초의 iPSC 유래 3D 대뇌 오가노이드 생성 프로토콜을 통해 대뇌 오가노이드는 자기 조직화, 보다 복잡한 구조 형성, 다른 전구 영역으로 변환, 세포 유형 구성/조직 모방 등의 능력을 갖춘 획기적인 기술이 되었습니다. 배아 뇌의 조직화이며 뇌의 공간 구조와 유사합니다7. 게다가, 배아기의 뇌 형성 및 발달 과정과 유사하게, 대뇌 오가노이드는 세포 다양성과 관련된 신호, 기능적 시냅스의 명확화, 수지상 돌기의 형성 및 형성과 관련된 신호와 같은 후성유전체 및 전사 프로그램을 생성함으로써 인간의 뇌를 밀접하게 모방할 수 있습니다. 자가 활성화 신경 네트워크8,9.
스피너10 및 셰이커11를 사용하는 기존의 대뇌 오르가노이드 성숙 접근법은 교반을 제공하여 자가 신경 조직 및 대뇌 심실 공간의 형성을 촉진합니다. 그러나 이러한 방법에는 혈관 형성 부족, 면역 세포 결핍, 마트리겔 의존성, 낮은 재현성, 확장성 및 유도된 뇌 구성 요소 및 세포의 높은 가변성으로 인한 영양 확산 및 세포 사멸 영역 변경을 포함하여 주요 제한 사항이 있습니다. 인간 제대 혈관 내피 세포(HUVEC)13 및 인간 iPSC 유래 내피 세포와 공동 배양하여 산소/영양분 확산을 향상시킬 뿐만 아니라 신경 분화, 이동 및 개발 중 회로 형성14. 다른 전략은 탈세포화된 뇌 세포외 기질(ECM)15 또는 합성 ECM 유사 기질을 사용하여 세포 미세생리학적 환경을 재현하는 데 중점을 두어 뇌 조직 형성 동안 신경 및 교세포 분화를 촉진합니다. 완전히 해결되지는 않았지만, 뇌 유기체의 낮은 재현성, 확장성 및 높은 가변성 문제는 다양한 유기체-칩 플랫폼18,19 또는 일회용 수직 휠 생물반응기20와 같은 새로운 생물반응기 시스템을 통해 극복하기 위해 시도되었습니다. 오가노이드 기술의 발전에도 불구하고 대뇌 오가노이드의 기계적 민감성 경로를 조절하는 전단 응력, 순환 스트레칭 및 유체 분포와 같은 혈역학적 힘은 아직 명확하게 이해되지 않았으며 이는 또 다른 중요한 한계입니다. 그러나 배아 발생 중 뇌척수액 흐름과 관련된 기계 감응 신호는 좌우 비대칭 효과를 통한 배아 형태의 방향, 방사형 교세포의 분극화, 신경 줄기 세포의 분화/기능화와 같은 중요한 구조적 적응을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 이후의 조직 접힘 이벤트21,22. 따라서 시공간 역학과 세포-세포/세포-환경 상호 작용을 에뮬레이트할 수 있는 생물학 및 공학 원리를 사용하여 플랫폼을 개발할 필요가 있습니다. 여기에서는 다양한 흐름 특성이 대뇌 오르가노이드의 성숙에 미치는 영향을 계산적 및 실험적으로 분석하고 분자, 세포 및 기능적 수준에서 iPSC 유래 3D 대뇌 오르가노이드를 엔지니어링하기 위한 최상의 전략을 도출합니다. 미세유체 플랫폼(μ-플랫폼)은 뇌척수 및 간질 공간에 존재하는 유체 흐름을 모방하는 중력 구동 층류를 허용하고 세포 간 누화, 산소 공급 및 영양분/폐기물 교환7,23을 향상시켜 더 오래 지속되는 오가노이드를 생성합니다. 또한 수평 회전 세포 배양 시스템(RCCS) 생물 반응기에 의해 비정상적으로 제공되는 미세 중력 및 층류 조건은 균질한 유체 역학적 힘을 나타내어 세포-세포 상호 작용의 장기 정밀 제어를 촉진하고 성숙한 대뇌 오가노이드의 높은 수확 가능성과 재현성을 허용합니다. 우주 기술의 특별한 조건에서 영감을 얻은 RCCS는24 기존 시스템25에 비해 전단 응력 감소, 질량 전달 증가 및 세포 손상 감소로 인해 오가노이드 연구에서 독특한 도구가 될 수 있습니다. 우리는 미세 중력과 중력 구동 층류 흐름이 대뇌 유기체의 성숙을 향상시켜 인간 배아 피질 발달의 특징을 요약하는 계층적으로 복잡한 공간 네트워크로 이어지는 가설을 세웁니다.
0.5, mostly for RCCS p = 0.9945). In spite of the low-velocity fields exercised in the RSSC and the µ-platform, nutrient mixing has been efficient to support organoid growth and low shear environment yielded homogeneous size distributions, which is of prime importance for multiplex testing in the pharmaceutical industry./p>40-day organoids with GABA polarity switch were regarded as indicators of progressive neuronal network maturation78. On the other hand, the glutamate level that was secreted from microglia was measured at around 20 µM in healthy in vitro neuronal cultures79,80. Given that, the change in the uptake and consequently release rate of extracellular glutamate in 60-day RCCS and µ-platform organoids and growth in organoid sizes might be associated with more mature states. One of the distinguishing features of neuronal circuits and maturation is the switch from excitatory to inhibitory GABAergic neurotransmission. GABA-A, a presynaptic GABAergic interneuron receptor that modulates neurotransmitter release in both peripheral and central synapses7,78,81,82,83, was more expressed in both RCCS and µ-platform organoids with CTIP2+ deep-layer of cortical neurons as of day 60 (Fig. 5a–c, Supplementary Fig. 2c). Thus, the neuronal network complexity was validated in RCCS and µ-platform organoids with the presence of both presynaptic glutamatergic VGLUT1+ and GABAergic GABA-A+ neurons, which are critically involved in neuronal network oscillations, as well as postsynaptic PSD95+ neurons, GFAP+/S100B+ astrocytes, and MBP+/OLIG2+ oligodendrocytes./p> 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 4 for independent replicates = 2). e The top five biological processes (Gene Ontology) and f tissue expression (tissues) enrichments of upregulated genes (Log2 transformation of fold regulation ≥1.9, p-value < 0.05, independent replicates = 2) of cerebral organoids matured in dynamic systems on day 120./p> 0.05, ****p < 0.0001) and e TUNEL apoptosis fluorescent staining images of sectioned organoids at days 60 and 120. DNAse-treated organoid section matured in the RCCS system is used as a control group. The DAPI-stained cell nucleus (blue), green fluorescent stained apoptotic zones in the cell nucleus (green), and white arrows indicate neural rosette-like structures (scale bars = 200 μm, independent replicates = 3, Zeiss Axio Vert.A1)./p> 0.05), the highest DNA breakage was observed in the shaker, where the organoids were exposed to the highest shear stress, whereas the lowest apoptotic signals were noted in µ-platform and RCCS organoids exposed to at least 100-fold less shear stress. Approaching day 120, the presence of apoptotic cells in the inner regions of the organoids cultured under static conditions dramatically increased to 89.6% ± 6.2 due to nutrient-oxygen deficiencies, as the organoid size increased91. Besides, the cellular damages in the peripheral regions of organoids matured in shaker and spinner cultures were observed to increase from day 60 to 120 (p < 0.0001, apoptotic zone of 73.8% ± 5.9 and 66.5% ± 6) due to uneven hemodynamic forces and higher shear stresses. On the other hand, the detection of few apoptotic cells in organoids cultured in µ-platform and RCCS yielded the highest survival rates with significantly lower apoptotic zones of 10.4% ± 4.2 and 16.5% ± 2.2, respectively. Consequently, organoids matured in dynamic systems showed more prominent cell viabilities by reduced cell deaths at the center of organoids with sufficient nutrient-gas supply and less cell apoptosis-induced organoid survival due to the effective agitation in different dynamic flow regimes compared to the static group6,92, mostly in the µ-platform12,93 and RCCS systems that provided complex cytoarchitecture in organoid maturation./p>95% harvestability. Although scale-up was not planned for this study, we presume that about 1000 matured organoids can be harvested in one batch, if we scale up to 500 ml RCCS STLVs, as such the µ-platform can be multiplied by connecting in a parallel or serial manner for scale-up purposes. This study suggests that RCCS and µ-platform organoids showing a high level of physiological fidelity can serve as functional preclinical models for testing new therapeutic regimens and benefit from multiplexing./p>350–400 µm./p> 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 were used. The Student's t-test was also used for qRT-PCR analyses (independent replicates = 2 with RNA isolate pool containing at least two organoids from the same batch). On the other hand, H&E, IF and TUNEL staining were made with three independent replicates using three individual organoids at different times, while WB analysis were carried out with two independent replicates using protein lysate pool from at least two organoids from the same batch./p>
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