Oct 25, 2023
활성 호산구는 대장염에서 숙주 방어 및 면역 반응을 조절합니다
자연 615권, 페이지
Nature 615권, 151~157페이지(2023)이 기사 인용
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지난 10년 동안 단일 세포 전사체학은 새로운 세포 유형과 상태를 밝혀내는 데 도움을 주었으며 건강과 질병에 대한 세포 개요서를 구축하는 데 도움이 되었습니다. 이러한 진전에도 불구하고 일부 서열분석이 어려운 세포는 조직 지도책에 없는 상태로 남아 있습니다. 호산구(다양한 인간 병리1,2,3,4,5에 연루된 파악하기 어려운 과립구)는 이러한 미지의 세포 유형 중 하나입니다. 호산구의 이질성과 이들의 다발성 기능을 뒷받침하는 유전자 프로그램은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 마우스 호산구에 대한 포괄적인 단일 세포 전사체 프로파일링을 제공합니다. 우리는 전사체, 표면 프로테옴 및 공간 위치가 다른 장내 호산구의 활성 및 기본 개체군을 식별합니다. 게놈 차원의 CRISPR 억제 스크린과 기능적 분석을 통해 우리는 인터루킨-33(IL-33)과 인터페론-γ(IFNγ)가 염증이 있는 결장에서 활성 호산구의 축적을 유도하는 메커니즘을 밝힙니다. 활성 호산구에는 살균 및 T 세포 조절 활성이 부여되며 보조 자극 분자 CD80 및 PD-L1을 발현합니다. 특히, 활성 호산구는 염증성 장 질환 환자의 소규모 집단의 고유판에 풍부하며 CD4+ T 세포와 밀접하게 연관되어 있습니다. 우리의 발견은 호산구의 생물학에 대한 통찰력을 제공하고 이 세포 유형이 장의 항상성, 면역 조절 및 숙주 방어에 중요한 기여를 한다는 것을 강조합니다. 또한, 우리는 인간의 위장 질환에서 호산구의 특성을 규명하기 위한 틀을 마련합니다.
호산구는 주로 흉선, 자궁, 폐, 지방 조직 및 위장관(GI)에 존재하는 과립구입니다1. 이들의 축적은 알레르기성 기도 염증, 아토피성 피부염, 호산구성 식도염 및 염증성 장질환(IBD)2,3,4,5와 같은 질병 상태의 전형적인 현상입니다. GI 호산구는 상피 장벽 보존, 조직 구조 지원, 면역 세포 집단 유지 및 국소 면역 반응 조절을 포함한 다양한 항상성 과정에 기여합니다6,7,8,9. 그러나 장 염증 중 이들의 기능은 불분명합니다. 더욱이, 기능적으로 구별되는 호산구 하위 집합의 존재와 그들의 개체 발생 관계는 전사체 심문을 방해하는 기술적 문제로 인해 대부분 조사되지 않은 상태로 남아 있습니다. 실제로 호산구는 인간과 마우스의 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 아틀라스에는 사실상 존재하지 않으므로 질병에 대한 세포 유형별 기여를 이해하는 데 맹점을 나타냅니다. 여기에서 우리는 골수(BM)에서 거주 조직까지의 발달 궤적을 따라 호산구 전사 및 기능적 이질성을 해결하고 장 염증 동안의 역할을 정의함으로써 지식의 이러한 격차를 메웁니다.
전단 응력, 탈과립 및 그에 따른 전사체 분해(확장 데이터 그림 1a)를 최소화함으로써 우리는 Il5-tg 마우스의 BM, 혈액, 비장, 위, 소장 및 결장에서 분리된 호산구로부터 단일 세포 전사체를 얻었습니다. 조직 전반에 걸쳐 호산구 수가 높습니다 13 (확장 데이터 그림 1b, c). 우리는 모든 세포의 89%가 선의의 호산구 마커 Siglecf, Il5ra, Ccr3 및 Epx를 광범위하게 발현한다는 것을 발견했습니다(확장 데이터 그림 1d). 클러스터링을 통해 발달 궤적을 따라 정렬된 5개의 하위 모집단이 나타났습니다(그림 1a,b). 고도로 순환하는 전구체와 미성숙 호산구는 주로 BM에 존재하고 순환 호산구는 주로 혈액에 존재합니다. 활성 호산구(A-Eos)와 기저 호산구(B-Eos)라고 불리는 두 가지 하위 집합은 다양한 비율로 GI 조직을 채웠습니다(그림 1c 및 확장 데이터 그림 1e).
a, Il5-tg 마우스(n = 3)의 BM, 혈액, 비장, 소장, 위 및 결장에서 얻은 호산구 전사체의 균일한 다양체 근사화 및 투영(UMAP). b, 호산구 분화 궤적. c, 장기 전체의 하위 집합 분포(호산구의 %). d, 클러스터 마커 유전자의 발현. 클러스터 마커의 전체 목록은 보충 표 1. e, Top, Cd80 및 Cd274 발현의 UMAP에서 확인할 수 있습니다. 하단, 의사 시간에 따른 발현 수준. f, 상단, 혈액, 비장, 위, 결장 및 소장에서 분리된 호산구 단백질체(스펙트럼 유동 세포측정) 프로파일의 UMAP. 하단, 하위 집합 전체에 걸친 중앙 표면 마커 표현의 히트 맵(n = 5, B6J). g, 장기 전체의 A-Eos(PD-L1+CD80+) 및 PD-L1-CD80- 호산구의 대표적인 FACS 플롯. 숫자는 호산구의 비율을 나타냅니다. h, 마우스 결장에서 Siglec-F 및 CD80의 대표적인 면역형광(n = 3, B6J). 화살표는 Siglec-F+CD80+ A-Eos(빨간색) 및 Siglec-F+CD80− B-Eos(녹색)를 표시합니다. DAPI로 염색된 핵. 스케일 바, 20μm. i, 결장 A-Eos 및 B-Eos(n = 6, B6J)에서 CD63, SSC-A 및 Siglec-F의 평균 형광 강도(MFI). 중앙값이 표시됩니다. 양측 unpaired Student's t-test. j, 왼쪽, 항-EPX 및 DAPI로 염색된 세포방사 장 A-Eos 및 B-Eos의 대표적인 이미지(n = 3, Il5-tg). 스케일 바, 10μm. 오른쪽, 세포 주변과 중앙에서 EPX 염색 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± sd 양측 짝이 없는 학생 t-검정입니다. k, 대장선와의 내강 대 기저 1/3의 활성-기저 비율(n = 3, B6J). 양측 쌍을 이루는 학생의 t-검정. l, 왼쪽, 건강한 인간 결장 코어의 결장 선와의 관강 대 기저 1/3의 활성 대 기저 비율(n = 5). 양측 쌍을 이루는 학생의 t-검정. 건강한 개인(5명, 9개 코어), 크론병 환자(CD; 5명, 9개 코어) 및 궤양성 대장염 환자(UC; 4명, 8개 코어) 샘플의 올바른 활성-기저 비율. 일원 분산 분석. 데이터는 평균 ± sd입니다. 환자 정보는 보충 표 2에 제공됩니다. a, b, e, f에서 점은 클러스터 ID로 색상이 지정된 단일 셀을 나타냅니다.
|2|) in BM-Eos treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). All DEGs are listed in Supplementary Table 4. Bottom, expression of subset markers across conditions. Columns are clustered, rows are scaled. CPM, counts per million. b, Proliferation of anti-CD3/CD28-activated, CFSE-labelled naive CD4+ T cells co-cultured with BM-Eos conditioned with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). Data are pooled from two independent experiments. Medians are shown. One-way ANOVA. c, A-Eos frequencies in mice treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 5, B6J). Medians are shown. One-way ANOVA. d, A-Eos and B-Eos frequencies in DSS-treated B6J (n = 5) and Il33−/− (n = 4) mice. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. e, Frequencies of IFNγ-, IL-17- and TNF-expressing colonic CD4+ T cells from mice in d. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. f, Left, representative haematoxylin and eosin (H&E)-stained colonic sections of mice in d. Scale bar, 100 µm. Right, colitis score assessed by histopathological examination. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. g, Representative molecular cartography images of human ulcerative colitis samples. Nuclei are stained with DAPI; CD4, SIGLEC8 and CD80 RNA molecules are shown in blue, red and yellow, respectively. Scale bar, 200 µm. h, Pairwise proximity score of transcripts across slides. The score indicates the fraction of slides in which the proximity of a pair of transcripts is significantly higher than expected by chance. P values are computed using a permutation test (Methods). Treg cells, regulatory T cells. i, Mean counts per slide of CD80 and NFKB1 transcripts in the proximity (<10 µm) of SIGLEC8 transcripts spatially associated with CD4 molecules versus SIGLEC8 molecules not associated with CD4 molecules. The central line in the box plot represents the median count per slide, the lower and upper hinge correspond to the first quartiles and the whisker extends from the hinge to the smallest or largest value no further than 1.5 times the interquartile range (IQR) from the hinge. Two-sided paired Wilcoxon test (17 regions of interest (ROIs), n = 4 patients)./p> 6). To quantify the co-expression of PD-L1 and MBP, the distance of each spot in the green channel to the nearest spot in the red channel was computed. Green spots (eosinophils) with distance to red spots < 4 µm were considered as active eosinophils (co-expressing PD-L1). Green spots with distance to red spots > 4 µm were considered basal eosinophils. The active-to-basal ratio was then computed by dividing the number of active by the number of basal eosinophils in each core. For localization analysis, the active-to-basal ratio in colon crypts of human and mouse tissue was calculated in manually drawn ROIs comprising the lower (basal) or upper (luminal) thirds./p> 0.5, P adjusted < 0.05) between A-Eos and tissue eosinophils. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). f, Representative FACS plots of PD-L1+CD80+and PD-L1−CD80− eosinophils in HDM- or PBS-treated mice (n = 2, B6J). Numbers indicate % of eosinophils. g, Left: Gating strategy used to identify resident (rEos) and inflammatory (iEos) eosinophils as described by17. Right: quantification of PD-L1+CD80+ and PD-L1−CD80− eosinophils in rEos and iEos. Medians are shown. h, MBP and PD-L1 immunofluorescence staining of human tissue microarrays. Representative cores from a healthy individual and a patient with Crohn's disease are shown (n = 5). Scale bars, 500 µm (core overview) and 10 µm (high magnification insets)./p> 0.5, adjusted P < 0.05) of circulating eosinophils found in the colon vs in the blood of C. rodentium-infected mice. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). g, Single-cell fate probabilities as calculated by CellRank and summarized for each cluster as a pie chart. Arrows represent velocity flow. Cells and pie charts coloured by cluster identity. h, Top: Workflow of in vitro conditioning. Bottom: A-Eos frequencies after conditioning with increasing doses of colon CM. Input: BM-derived (n = 5, B6J), blood (n = 5, Il5-tg) and splenic (n = 5, Il5-tg) eosinophils. Medians are shown. One-way ANOVA. i, Left: EYFP+ eosinophil frequencies over time across organs after single tamoxifen pulse in Id2CreERT2;RosaEYFP mice. Data represents mean ± SD. Right: Frequency of A-Eos and B-Eos in colonic EYFP+ eosinophils at day 2 and 4 post tamoxifen injection (n = 3, Id2CreERT2;RosaEYFP). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. j, Antimicrobial and granulogenesis signature expression in A-Eos. k, Gene expression over common pseudotime at steady state (grey) and upon C. rodentium infection (dark red). Dots indicate single cells, coloured by organ: BM (blue), blood (yellow) and colon (red). l, Edu+/Edu− eosinophil ratio in the colon of C. rodentium-infected and control B6J (n = 5) and Il5-tg (n = 3) mice at day 4 post EdU injection. Data represent mean ± SEM. Two-tailed unpaired Student's t-test. m, Frequencies of eosinophil progenitors (gated as Live CD45+CD11b+IL5Ra+Lin-Sca1−CD34+) in C. rodentium-infected (n = 17) and control (n = 9) B6J mice. Medians are shown. Data pooled from two independent experiments. Two-tailed unpaired Student's t-test. n, MFI of CD63 in colonic A-Eos and B-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 6, B6J). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. o, EPX immunofluorescence of sorted A-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 5, Il5-tg). Nuclei are stained with DAPI. Insets show protrusions. Scale bar, 10 µm./p> 
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