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장 점막 해리 프로토콜은 세포 유형 비율과 단일에 영향을 미칩니다.

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Apr 29, 2023

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Apr 30, 2023

장 점막 해리 프로토콜은 세포 유형 비율과 단일에 영향을 미칩니다.

과학 보고서 12권,

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 9897(2022) 이 기사 인용

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단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq)은 장기의 세포 구조 연구에 혁명을 일으켰습니다. 대부분의 단일 셀 프로토콜에는 새로운 재료가 필요하므로 실험당 샘플 크기가 제한되고 결과적으로 배치 효과가 발생합니다. 이는 장 점막 생검과 같은 복잡한 의료 절차를 통해 얻은 샘플의 경우 특히 그렇습니다. 더욱이, 단일 세포를 얻기 위해 필요한 조직 해리 절차는 소음의 주요 원인입니다. 조직의 서로 다른 구획에 적용되는 서로 다른 해리 절차는 세포 하위 집합 간의 인공적인 유전자 발현 차이를 유도합니다. 이러한 과제를 극복하기 위해 우리는 1단계 해리 프로토콜을 개발하고 냉동 보존된 장 점막 생검에 대한 사용을 시연했습니다. 유세포 분석 및 scRNA-seq 분석을 사용하여 이 1단계 해리 프로토콜을 현재의 표준, 2단계 콜라게나아제 소화 및 최근 발표된 대안인 3단계 저온 활성 Bacillus licheniformus 프로테아제 소화의 적응과 비교했습니다. 세포 생존력과 세포 유형 구성 모두 1단계와 2단계 콜라게나제 해리 사이에서 비슷했으며, 전자가 더 시간 효율적이었습니다. 차가운 프로테아제 소화는 동일한 세포 생존성을 가져오지만 상피 세포 유형을 더 잘 보존합니다. 결과적으로, 신경교 세포와 같은 희귀한 세포 유형을 분석하려면 입력 자료로 더 큰 총 생검 세포 수가 필요합니다. 다단계 프로토콜은 여러 구획에 걸쳐 있는 세포 유형에 다르게 영향을 미쳤습니다. 요약하자면, 우리는 대규모 scRNA-seq 연구에서 물류 문제와 배치 효과를 극복하기 위해 냉동보존된 장 점막 생검을 사용할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 우리는 1단계 콜라게나제 프로토콜을 사용하여 소화된 냉동 보존 생검을 사용하면 대규모 scRNA-seq, FACS, 오가노이드 생성 및 상피내 림프구 확장이 가능하다는 것을 입증합니다.

최초의 cDNA가 단일 세포에서 추출된 것은 30여 년 전이지만1, 단일 세포 RNA 서열분석(scRNA-seq) 분야의 기술 발전으로 단일 세포 유전자 발현 프로파일링이 가능해진 것은 아주 최근의 일입니다. 높은 처리량 방식으로2. 이러한 개발을 통해 세포 유형을 별도로 분리할 필요 없이 조직 내 이종 세포 집단에 대한 편견 없는 연구가 가능해졌습니다. 세포 발현을 매핑하는 것 외에도 조직의 맥락에서 잠재적인 세포-세포 상호 작용을 연구할 수 있습니다3.

건강(Human Cell Atlas4)과 질병(LifeTime 컨소시엄5) 모두에서 단일 세포 분해능으로 인체를 매핑하기 위한 여러 전 세계적 노력이 진행 중입니다. 이미 많은 노력이 이루어지고 있는 분야 중 하나는 위장병학 분야입니다. 태아, 소아 및 성인의 '건강한' 장 지도책이 (현재) 생성됩니다6,7. 이를 통해 pH 감지에 관여하는 BEST4 상피 세포와 같은 새로운 세포 유형과 그 특정 기능이 확인되었으며8 일부 크론병 환자가 특정 약물에 반응하지 않는 이유에 대한 첫 번째 단서를 제공했습니다9.

장 점막은 여러 구획으로 나눌 수 있는 복잡한 기관입니다. 관강 부분에 위치한 상피층; 그리고 상피 아래에 있는 고유층(lamina propria) 층. 각 구획은 특수하고 국소적인 기능을 가질 수 있고 위장관 전반에 걸쳐 차등적으로 분포되는 세포 유형의 혼합물로 구성됩니다. 관강 측면에서 장 점막은 무세포 점액층으로 구성되어 장내 세균을 상피로부터 분리합니다. 이 층은 외부 세계와 내부 장 구획 사이의 두 번째 장벽 역할을 합니다. 바로 아래에는 면역 세포가 침투하여 항균 방어 및 항원 신호 전달을 위한 특정 기능을 수행하는 상피층이 있습니다. 여기에만 존재하는 이러한 면역 세포 집단 중 하나는 상피내 림프구 집단(IEL)이며, 이는 기본 층인 고유판(LPL)의 림프구와 기능적으로 다릅니다. 후자의 층에는 다른 면역 세포, 혈관계, 신경 및 중간엽 세포도 포함되어 있습니다.

 0.05, non-paired t-test)./p> 0.05; non-paired t-test). Sample size is depicted in the lower part of the plot. UMAPs of scRNA-seq data obtained from two-paired fresh and cryopreserved samples dissociated with one-step collagenase colored by (B) cell types and (C) storage condition. (D) Bar plot of relative cell type frequencies recovered from the scRNA-seq data colored by cell-type./p> 10 ml of RT PBS−/− is added to minimize residual effects of the collagenase-EDTA reagents, after which cells are centrifuged for 5 min at 300 g at RT. The pellet is resuspended in 100ul TrypLE Express Enzyme and incubated for 1.5 min in a 37 °C water bath. The enzymatic reaction is stopped by adding cold RPMI1640 with 2% heat-inactivated FCS and the cells are centrifuged for 5 min at 300 g at 4 °C. Next, the pellet is resuspended in cold wash buffer I (PBS -/- supplemented with 0.4% BSA and 10 iU/mL DNase II) and filtered through a 70 um cell strainer. To maximize cell collection, the filter is washed once more with cold wash buffer II (PBS -/- supplemented with 0.4% BSA) and the cells are collected after centrifugation for 5 min at 300 g at 4 °C./p> 60% mitochondrial reads. Hashtag data was normalized using centered-log ratio transformation and HTODemux was used to assign a hashtag ID to each cell. Only single, hashtag-IDed cells were selected for further analysis./p> 100 cells per group were included in the analyses, and only genes present in all of the compared groups were included in the subsequent pathway analyses./p>